Functional analysis of cap dependent translation after fertilization and during the cell cycle in sea urchin embryo
Analyse fonctionnelle de la traduction dépendante de la coiffe m⁷GTP en réponse à la fécondation et au cours du cycle cellulaire de l'embryon d'oursin
Résumé
Sea urchin eggs fertilization induces a protein synthesis increase required for cell cycle entry and progression in embryo. Translation initiation represents a rate limiting step. eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) is a cap binding protein that regulates protein synthesis according to its partners 4E-BP (eIF4E Binding Protein) and eIF4G (eukaryotic Initiation Factor 4G). Fertilization provokes eIF4E/4E-BP dissociation. Our results indicate that several isoforms of eIF4G are present in unfertilized eggs and post-translationally modified after fertilization. These isoforms associate with eIF4E after fertilization. eIF4E/4E-BP dissociation and eIF4E/eIF4G association are required for the first mitotic division. eIF4E/4E-BP dissociation is classically described as dependent on 4E-BP hyperphosphorylation; we show that in sea urchin, 4 phosphorylation sites are conserved on 4E-BP. Sea urchin 4E-BP fusion proteins, wild type and mutant mimicking hyperphosphorylation, associate with eIF4E in vitro and inhibit cap dependent translation in cell free extracts. These results suggest that 4E-BP phosphorylation induced after fertilization is not sufficient to release eIF4E and highlight the role of 4E-BP degradation in protein synthesis regulation in sea urchin. We show that 4E-BP, eIF4G, eIF4E, eIF2 (eukaryotic Initiation Factor 2) and eEF2 (eukaryotic Elongation Factor 2) are modified after sea urchin eggs fertilization but also after artificial activation by calcium ionophore or NH4Cl. These modifications mediated by artificial activation induce cyclin B synthesis but are not sufficient to activate CDK1/cyclin B and cell division. Finally, we show that 4E-BP/eIF4E complex is also regulated during the meiotic maturation in starfish oocytes. In these physiological conditions, cyclin B synthesis involves regulations different from the ones observed after sea urchin eggs fertilization.
Chez l’oursin, la fécondation induit une augmentation de synthèse protéique indispensable à l’entrée et à la poursuite du cycle cellulaire de l’embryon. L’une des étapes limitantes pour la traduction est l’initiation. La protéine eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) se lie à la coiffe m7GTP des ARNm et régule la synthèse protéique en fonction de ses partenaires 4E-BP et eIF4G. La fécondation dissocie eIF4E de son répresseur 4E-BP (eIF4E-Binding Protein). Nos résultats montrent que dans les ovules, eIF4G (eukaryotic Initiation Factor 4G) se présente sous plusieurs isoformes qui sont modifiées de façons post-traductionnelles en réponse à la fécondation. Ces isoformes s’associent à eIF4E après fécondation. La dissociation eIF4E/4E-BP et l’association eIF4E/eIF4G sont nécessaires à la première division cellulaire. La dissociation eIF4E/4E-BP est classiquement décrite comme dépendante de l’hyperphosphorylation de 4E-BP ; nous montrons que chez l’oursin, 4 sites de phosphorylation sont conservés sur 4E-BP. Les protéines de fusion de 4E-BP, sauvage ou mimant une hyperphosphorylation, s’associent à eIF4E in vitro et inhibent la traduction dépendante de la coiffe dans des extraits acellulaires d’oursin. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de 4E-BP induite après fécondation n’est pas suffisante pour libérer eIF4E et met en avant l’importance de la dégradation de 4E-BP dans le contrôle de la synthèse protéique chez l’oursin. Nous montrons que les facteurs 4E-BP, eIF4G, eIF4E, eIF2 (eukaryotic Initiation Factor 2) et eEF2 (eukaryotic Elongation Factor 2) sont modifiés en réponse à la fécondation mais aussi après activation artificielle des ovules d’oursin par le calcium ionophore et le NH4Cl. Ces modifications induites après activation artificielle permettent de synthétiser la cycline B mais sont insuffisantes pour activer le complexe CDK1/cycline B et entraîner la division cellulaire. Enfin, nous montrons que le complexe 4E-BP/eIF4E est aussi régulé au cours de la maturation méiotique de l’étoile de mer. Dans ces conditions physiologiques, la synthèse de la cycline B implique des régulations différentes de celles observées après fécondation chez l’oursin.