Mechanisms of actions by cyclin-dependent kinase inhibitors : identification of their intracellular targets by affinity chromatography
Mécanismes d'action des inhibiteurs de kinases cyclines-dépendantes : identification de leurs cibles intracellulaires par chromatographie d'affinité
Résumé
Among the estimated 850 human protein kinases, the family of cyclin-dependent kinases (CDK) has been extensively studied because of its essential cellular functions. CDKs play a key role in ceil cycle control, transcription, differentiation, apoptosis and in neuronal cell functions. The observation that CDKs are frequently deregulated in cancers has stimulated an active search for chemical inhibitors of this class of kinases. 60 far, more than 50 compounds have been identified, on the basis of their ability to inhibit in vitro purified CDK activity. These compounds display antiproliferative, anti-neurodegenerative, anti-viral and anti-parasitic properties. The anticancer potential of the most promising compounds is currently evaluated in pre-clinical and clinical trials. The aim of this study is to understand the intracellular mechanism of action of CDK inhibitors. We chose to approach this question by investigating their in vivo selectivity, i.e. the scope of their real intracellular targets. lndeed, CDK inhibitors have been identified on their ability to inhibit purified CDKs in vitro but their actual intracellular targets remain unverified. To address this question, we developed an affinity chromatography approach allowing to purify, from cellular extracts, the intracellular targets of the inhibitor. This technique was used to study the selectivity of three CDK inhibitors belonging to different chemical classes: the purine purvalanol, paullones and indirubin-3’-monoxime. For each compound, the expected targets were recovered from the matrix. However this approach has also allowed the identification of several unexpected interactions between CDK inhibitors and other enzymes, kinases (p42/p44 MAPKs with purvalanol) or other (malate dehydrogenase with paullones and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with indirubin). In each case, the molecular basis of the interaction between the inhibitor and its new target was investigated by testing the in vitro sensitivity 0f the target enzyme to the compound. Based on these results, we next investigated more in detail how the interaction between MAPKs and purvalanol participated to the cellular effects of the drug. Lastly, this affinity chromatography approach was used to understand two particular cellular effects of purvalanol: its antiviral activity against herpes simplex virus (HSV-1) and the induction of supernumerary hair cells in Organs of Corti of rat embryos. In conclusion, this affinity approach has confirmed the strong interactions between CDK inhibitors and the enzymatic targets they have been optimised on. In addition, this technique has allowed the identification of several unexpected targets for CDK inhibitors, the identity of which could not be deduced from in vitro classical selectivity studies, and the inhibition of which may participate to the observed cellular effects of the compounds.
Parmi les 850 protéines kinases estimées du génome humain, la famille des kinases cyclines dépendantes (CDK) a fait l’objet de nombreuses études en raison de ses fonctions cellulaires essentielles. Les CDKs interviennent dans le contrôle du cycle cellulaire, mais aussi dans la transcription, la différenciation, l’apoptose ou le développement et le fonctionnement du système nerveux central. Très fréquemment, des dérégulations des CDKs sont observées dans les cancers, et ces observations ont encouragé la recherche d’inhibiteurs chimiques de leur activité catalytique en vue d’applications thérapeutiques. A l’heure actuelle, plus de cinquante inhibiteurs chimiques de CDKs ont été identifiés sur la base de leur capacité à, inhiber in vitro l’activité de CDKs purifiées. Ces inhibiteurs ont des propriétés antiprolifératives, anti-neurodégénératives, anti-virales et anti- parasitaires. Le potentiel anticancéreux des composés les plus prometteurs est actuellement évalué dans des études pré-cliniques et cliniques. Ce travail de thèse porte sur la compréhension du mécanisme d’action intracellulaire des inhibiteurs de CDKs. Nous avons choisi d’aborder cette question en nous intéressant à l’identification des cibles intracellulaires de ces composés. En effet, même si ces inhibiteurs ont été mis au point sur la base de leur capacité à inhiber efficacement les CDKs in vitro, leurs cibles réelles dans la cellule ne sont pas connues. Pour répondre à cette question, nous avons développé une approche de chromatographie d’affinité permettant de repêcher, dans des extraits cellulaires, les cibles intracellulaires des inhibiteurs. Nous avons ainsi étudié la sélectivité de trois inhibiteurs de CDKs différents, le purvalanol, les paullones et l’indirubine. Pour chacun des composés, les cibles connues ont été retrouvées sur la matrice. Mais celle approche nous a permis de mettre en évidence des interactions inattendues entre les inhibiteurs de CDKs et d’autres enzymes, kinases (p42/p44 MAPKs avec le purvalanol) ou autres (malate déshydrogénase mitochondriale avec les paullones et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase avec l’indirubine) Dans chacun des bas, nous avons étudié la base moléculaire des interactions entre l’inhibiteur de CDKs et sa nouvelle cible en vérifiant que l’activité de l’enzyme était sensible à l’inhibiteur. A partir de ces résultats, nous avons examiné plus en détail comment l’interaction entre le purvalanol et les MAPKs participait aux effets cellulaires antiprolifératifs du composé. Enfin, la technique de chromatographie d’affinité sur inhibiteur immobilisé pour identifier les cibles des composés a été mise à profit pour mieux comprendre deux effets cellulaires du purvalanol l’inhibition de la réplication du virus de l’herpes simplex (HSV-1) et l’apparition de cellules ciliées surnuméraires dans l’organe de Corti d’embryons de rats. En conclusion, la technique de chromatographie d’affinité sur inhibiteur immobilisé a permis de confirmer les fortes interactions qui existent entre les inhibiteurs de CDKs et les cibles sur lesquelles ils ont été optimisés. Mais surtout, elle a permis de découvrir des cibles inattendues, dont l’existence n’aurait pu être déduite des résultats des tests in vitro et dont l’inhibition participe certainement aux effets pharmacologiques des composés.