EEF-1B factor and elongation regulation of protein synthesis in embryo urchin Sphaerechinus granularis
Le facteur EEF-1B et la régulation de l'élongation de la synthèse protéique dans l'embryon d'oursin Sphaerechinus granularis
Résumé
Protein synthesis is composed of three phases: initiation, elongation and termination. The eEF elongation factor-1 contains two elements: G protein, eEF-1A and a complex macromolecular exchange GDP / GTP, eEF-1B. In higher animals, eEF-1B consists of four subunits eEF-1βγδ and Vanyl-tRNA synthetase (Val-RS).
We cloned and sequenced both 2 and 2.7 kb cDNA encoding eEF-1δ in the sea urchin Sphaerechinus granularis. They differ only in the length of their 3'UTR. Their expression is regulated and decoupled from that of eEF-1A during early development.
Phylogenetic analysis shows that eEF-1δ comes from the fusion of a C-terminal domain of the ancestral gene β with a domain Leucine Zipper.
From a recombinant protein from the cDNA encoding eEF-1δ, we obtained a specific antibody. It allowed us to show that eEF-1δ protein exists in the egg of the sea urchin, in two isoforms present in a high molecular weight complex and eEF-1δ is strongly associated with eEF-1γ. Proteins having homologies with a chaperone protein and a ribosomal protein are still associated with eEF-1δ during purification.
The use of polyamines at physiological concentrations showed an inhibitory effect of the elongation phase in a cell lysate urchin.
A synthetic messenger without specific initiation was translated in rabbit reticulocyte lysates to understand the role of the association of the Val-RS to the complex. According to the ribosome binding site, leading to a polyvaline polyserine or peptide. The translated polyvaline is always greater than the polyserine. Phosphorylation with CDK1 / cyclin B decreases elongation and increases polyvaline Cele polyserine, suggesting a regulation of CDK1 by phosphorylation of the elongation of the eEF-1B subunit.
La synthèse protéique est composée de trois phases : l'initiation, l'élongation et la terminaison. Le facteur d'élongation eEF-1 contient deux éléments : une protéine G, eEF-1A et un complexe macromoléculaire d'échange de GDP/GTP, eEF-1B. Chez les animaux supérieurs, eEF-1B est constitué de quatre sous-unités eEF-1βγδ et la Vanyl-ARNt synthétase (Val-RS).
Nous avons cloné et séquencé deux ADNc de 2 et 2,7kb codant pour eEF-1δ chez l'oursin Sphaerechinus granularis. Ils diffèrent uniquement par la longueur de leur région 3'UTR. Leur expression est régulée et découplée de celle de eEF-1A au cours du développement précoce.
L'analyse phylogénétique montre que eEF-1δ provient de la fusion d'un domaine C-terminal du gène ancestral β avec un domaine Leucine Zipper.
A partir d'une protéine recombinante issue de l'ADNc codant pour eEF-1δ, nous avons obtenu un anticorps spécifique. Il nous a permis de montrer que la protéine eEF-1δ existe, dans l'ovule de l'oursin, sous deux isoformes présentes dans un complexe de haut poids moléculaire et que eEF-1δ est fortement associée à eEF-1γ. Des protéines présentant des homologies avec une protéine chaperon et une protéine ribosomale restent associées à eEF-1δ au cours de la purification.
L'utilisation de polyamines à des concentrations physiologiques a montré un effet inhibiteur de la phase d'élongation dans un lysat acellulaire d'oursin.
Un messager synthétique, sans initiation spécifique, a été traduit dans des lysats de réticulocytes de lapin pour comprendre le rôle de l'association de la Val-RS au complexe. Selon le site de fixation du ribosome, il conduit à un peptide polyValine ou polySérine. La traduction du polyValine est toujours supérieure à celle du polySérine. La phosphorylation avec CDK1/cycline B diminue l'élongation du polyValine et augmente cele du polySérine, suggérant une régulation de CDK1 sur l'élongation par phosphorylation des sous-unités de eEF-1B.
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